乙型肝炎病毒耐药相关的基因突变检测试剂注册技术审查指导原则（2020年第16号）

附件：乙型肝炎病毒耐药相关的基因突变检测试剂注册技术审查指导原则（2020年第16号）.doc

乙型肝炎病毒耐药相关的基因突变检测试剂
注册技术审查指导原则

本指导原则旨在指导注册申请人对乙型肝炎病毒耐药相关的基因突变检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。

本指导原则是针对乙型肝炎病毒耐药相关的基因突变检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。

本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导性文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。

一、适用范围

（一）临床背景

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染呈世界性流行，但不同地区HBV 感染的流行强度差异很大。全国2006年乙型肝炎血清流行病学调查表明，我国1-59岁一般人群乙型肝炎表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HBsAg）阳性率为7.18%，2014年中国疾病预防控制中心开展的全国1—29岁人群乙型肝炎血清流行病学调查结果显示，1—4岁、5—14岁、15—29岁人群HBsAg阳性率分别为0.32%、0.94%和4.38%，我国现有HBV感染者约有8000万。在临床治疗慢性乙型肝炎病毒感染的方案中，使用抗病毒药物是最主要的手段。抗HBV药物主要包括干扰素α和核苷（酸）类似物两大类，其中核苷（酸）类药物服用便捷，抗病毒效力强，不良反应较小，但核苷（酸）类药物在抗HBV治疗中需要长期服药，一旦出现病毒耐药，可能导致治疗失败、病毒DNA反弹、肝功能恶化甚至肝衰竭。因此，如何发现病毒耐药突变，进而合理调整治疗方案，在慢性乙型肝炎临床治疗中具有极其重要的意义。

HBV属于嗜肝DNA病毒科（hepadnaviridae），HBV基因组含有4个部分重叠的开放读框（ORF），即前-S/S区、前-C/C 区、P区和X区。其中P区编码聚合酶/逆转录酶，目前已知的核苷（酸）类药物的耐药突变均发生在HBV的P区。HBV虽然属于DNA病毒，但其复制需经过以前基因组RNA为复制中间体的逆转录过程。在此过程中，HBV逆转录酶由于缺乏严格的校正机制，导致HBV复制过程中核苷酸错配率较高。HBV复制的这种过程和特点，导致同一患者体内不同的HBV株基因序列之间也存在差异，因此，每一个患者体内的病毒都是由不同基因序列的病毒株组成的动态变化的病毒准种，不同基因序列的病毒株在病毒准种中所占的相对比例，一方面取决于病毒株自身的复制能力，另一方面也受到机体免疫系统或药物的选择压力的影响。

抗病毒药物核苷（酸）类似物进入机体后，形成三磷酸活性成分，与机体天然的脱氧三磷酸核苷（dNTP）竞争性结合到HBV聚合酶上，使HBV的DNA链合成终止。如果患者体内的HBV P区序列发生突变，导致产生的HBV聚合酶与核苷（酸）类似物结合力降低，突变的HBV即不受核苷（酸）类似物的抑制或抑制能力下降，在继续应用核苷（酸）类似物治疗的情况下，突变株病毒由于对核苷（酸）类似物不敏感而逐渐成为优势株，从而导致患者对于核苷（酸）类似物的耐药。

乙型肝炎病毒的耐药突变分为原发性耐药突变和补偿性耐药突变，原发性耐药突变指药物作用靶位的基因及其编码的氨基酸发生突变，导致突变病毒株对治疗药物的敏感性下降。虽然原发性耐药突变株对药物的抵抗性增加，但也常导致突变病毒本身的复制能力下降。补偿性耐药突变指由于原发性耐药突变病毒株复制能力下降，在原发性耐药突变的基础上，病毒株在其它位点发生突变，这些突变可部分恢复突变病毒的复制能力或可导致突变病毒对药物敏感性的进一步下降。

目前经国家药品监督管理局批准用于抗HBV治疗的核苷（酸）类似物有拉米夫定（LAM）、阿德福韦酯（ADV）、恩替卡韦（ETV）、替比夫定（LdT）、替诺福韦酯（TDF）和富马酸丙酚替诺福韦（TAF）等。与拉米夫定常见耐药相关的突变为rtM204I/V和rtL180M，其中rtM204V多与rtL180M联合出现，rtM204I可单独出现。与阿德福韦酯常见耐药相关的突变为rtN236T与rtA181V/T，两个位点可单独或联合出现。与恩替卡韦常见耐药相关的突变是在rtM204V+rtL180M基础上，再联合rtT184、rtS202或rtM250三个位点中至少一个位点的氨基酸替代突变。与替比夫定常见耐药相关的突变为rtM204I，其它位点如rtA181V/T等尚存在争议。替诺福韦酯和富马酸丙酚替诺福韦目前尚未发现确认的耐药突变。

HBV耐药相关的检测主要包括基因型耐药检测和体外表型分析等。

HBV基因型耐药检测是指采用分子生物学方法检测已在体外表型分析中被证实与抗病毒药物耐药相关的HBV突变的临床检测。目前已批准产品采用的方法主要包括：PCR-测序法（direct PCR sequencing）、基因芯片法（gene chip）、PCR-反向杂交法（PCR-reverse hybridization assay）、实时荧光PCR法（real-time PCR）等。

HBV体外表型分析（in vitro phenotypic analysis）是公认的确认耐药的检测方法，通过体外复制系统证实检测到的HBV突变会降低其对抗病毒药物的敏感性，常用半数有效浓度（50% effective concentration，EC50）或半数抑制浓度（50% inhibitory concentration，IC50）来评价耐药程度的高低。其方法是将含有待检测耐药突变位点的HBV全基因组导入肝细胞来源的细胞系，再将不同浓度梯度的核苷（酸）类似物加入细胞培养液中，经过一定培养时间后检测药物作用下HBV DNA的复制情况，计算EC50，通过与野生株病毒的EC50比较，判断该突变对核苷（酸）类似物的敏感性。当抑制病毒复制所需的EC50与野生株相比增加l00倍以上称为高度耐药、l0—99倍为中度耐药、2—9倍为轻度耐药。

（二）本指导原则适用范围

本指导原则所述乙型肝炎病毒耐药相关的基因突变检测试剂是指利用分子生物学技术，对人体血清/血浆样本中乙型肝炎病毒耐药突变位点进行定性检测的试剂。临床适用人群为核苷（酸）类似物治疗过程中出现病毒学突破的患者。除非有明确证据表明初治患者感染HBV来自接受核苷（酸）类似物抗病毒治疗患者，一般不主张对初治患者进行基因型耐药检测。

本指导原则是基于实时荧光PCR方法对产品相关申报资料提出要求，其他方法学的产品可依据产品特性确定其中具体内容是否适用，如不适用，可另行选择符合自身方法学特性的技术要求或评价方法。

本指导原则适用于进行产品注册和相关许可事项变更的产品。其他未尽事宜应当符合《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）（以下简称《办法》）等相关法规要求。

二、注册申报资料要求

（一）综述资料

综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、有关产品主要研究结果的总结和评价以及同类产品批准上市情况及异同比较等内容，其中，预期用途应明确所检测的耐药突变位点，所检测的耐药突变位点与相应药物的相关性，该突变位点为原发性耐药突变还是补偿性耐药突变，耐药性突变对药物敏感性的影响，相应药物累积耐药发生率以及是否有交叉耐药等。同类产品情况应着重从所检耐药突变位点、相关产品所采用的技术方法、性能指标、临床应用情况以及境内外批准上市情况等方面阐述申请注册产品与境内外同类产品的异同等。对于新的耐药突变位点，需要提供新位点与预期药物敏感性之间关系的文献资料，包括但不限于国内相关指南或专家共识，以及基于中国人群的充分的临床数据等。

综述资料的撰写应符合《办法》和《体外诊断试剂注册申报资料要求及说明》（国家食品药品监督管理总局公告2014年第44号）（以下简称44号公告）的相关要求。

（二）主要原材料研究资料

以实时荧光PCR方法为例，应提供引物、探针、DNA聚合酶、dNTP、尿嘧啶糖基化酶（如有）等主要原材料的选择与来源、制备及质量标准等的研究资料、质控品的确认试验资料以及企业参考品的原材料选择、来源、质量指标、制备方法及阴阳性的确认过程等的研究资料。

若主要原材料为企业自行生产，其生产工艺必须相对稳定，并提交主要原材料制备过程的研究资料；如主要原材料购自其他供应商，则需针对供应商的选择提供评价数据，并提供供应商出具的质量标准、出厂检定报告，以及申请人对该原材料进行的质量检验资料。

1. 核酸分离/纯化组分（如有）的原理介绍、主要组成、主要原材料的质量控制标准及相关验证资料。

2. 引物和探针：包括申报产品检测靶序列的引物和探针以及内对照的引物和探针。应详述引物和探针的设计和筛选的过程，提供引物、探针核酸序列、模板核酸序列及两者的对应情况，并提交筛选的研究数据。引物、探针的质量标准应至少包括序列准确性、纯度检查、浓度检查及功能性实验等。

3. 酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶，其质量标准如下：

3.1 DNA聚合酶应包括DNA聚合酶活性、无核酸内切酶活性、热启动能力（如适用）、热稳定性等。

3.2如申报产品中包含尿嘧啶DNA糖基化酶，应对其酶活性及热稳定性等质量控制标准进行规定，如使用其他工具酶，应提供其详细的研究资料。

4. dNTP：质量标准应包括纯度、浓度、保存稳定性及功能性实验等。

5. 试剂盒质控品

试剂盒的质控体系通过设置各种试剂盒质控品来实现。对于此类产品，质控体系主要包括阳性质控品、阴性质控品和内对照。申请人应明确质控品的原料来源、质量标准、质控品阴阳性的确认方法，并提交相关验证资料。各种质控品均应参与样本处理和检测的全过程，如核酸的平行提取等步骤，并且与被测临床样本在整个试验过程中保持相同的检测方式，质控品的基质应与实际检测样本基质一致或接近。

有关质控品和内对照的具体要求包括以下几个方面：

5.1阳性质控品中应包含试剂盒所检测的主要突变类型，建议采用含有灭活乙肝病毒或假病毒的样本。企业应对阳性质控品的检测结果做出明确的范围要求（如Ct值）。

5.2阴性质控品应包含未发生耐药突变的野生型乙肝病毒核酸，可采用含有灭活乙肝病毒或假病毒的样本，对可能存在的交叉污染产生的假阳性结果进行质量控制。

5.3内对照（内标）可以对管内抑制导致的假阴性结果进行质量控制，申请人应对内对照（内标）的引物、探针设计和模板浓度做精确验证，既要保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线又要尽量降低对靶基因检测造成的抑制。对内对照的检测结果亦应做出明确的范围要求（如Ct值）。

6. 企业参考品：应提交有关企业参考品的原料选择、制备、阴阳性确认等试验资料。企业参考品应充分考虑产品性能验证的需要进行设置。具体要求如下：

6.1阳性参考品

阳性参考品制备应采用经灭活的、待测乙肝病毒耐药突变阳性的样本，通过测序、同类已上市产品检测或者其他恰当的方法确认耐药突变情况。阳性参考品应包含试剂盒所能检测的所有耐药突变位点，对于罕见突变型或复杂突变型可采用假病毒样本。

6.2阴性参考品

阴性参考品制备应采用经灭活的、确认靶序列未发生待测突变的乙肝病毒阳性样本，样本类型与适用样本类型一致。同时应尽量包含适用范围以外的其它乙肝病毒基因突变阳性样本，和其它病原体阳性样本。

6.3检测限参考品

可选择最低检测限水平或略高于检测限的水平，明确参考品中乙肝病毒核酸浓度和乙肝病毒基因突变百分率，应包含所有的耐药突变位点，采用适当的阳性检出率（如95%（n≥20））作为最低检测限参考品的评价标准。检测限参考品可采用经灭活的、待测乙肝病毒耐药突变阳性样本和假病毒等模拟核酸样品进行适当的配制。

6.4精密度参考品

精密度参考品应包含申报产品声称的主要耐药突变位点，试剂盒包含不同反应体系时，精密度参考品应至少包含每个反应体系的代表性位点，并至少包括弱阳性（低浓度突变）水平。精密度参考品制备应采用经灭活的、待测乙肝病毒耐药突变阳性的样本。

（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料

1. 介绍产品主要生产工艺，可以图表方式表示，并说明主要生产工艺的确定依据。

2. 反应原理介绍。

3. 详述样本采集、样本处理方式的选择和设置，提供相关的研究资料。

4. 确定最佳反应体系的研究资料，包括样本类型、样本用量、各种酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度、阳离子浓度及反应各阶段温度、时间、循环数等。

5. 不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述，并提交验证资料。

6. 如申报产品包含核酸分离/纯化试剂，应提交对核酸分离/纯化过程进行工艺优化的研究资料。

（四）分析性能评估资料

申请人应提交产品研制阶段对试剂盒进行的所有性能评价的研究资料，对于每项分析性能的评价都应包括具体研究目的、试验方法、可接受标准、试验数据、统计方法等详细资料。有关分析性能验证的背景信息也应在申报资料中有所体现，包括实验地点、适用仪器、试剂规格、批号和临床样本来源等。

分析性能评价的试验方法可以参考相关的美国临床实验室标准化协会批准指南（CLSI-EP）文件或国内有关体外诊断试剂性能评估的指导原则进行。各项性能评价应符合以下要求。

1. 核酸分离/纯化性能（如适用）

在进行靶核酸检测前，应有适当的核酸分离/纯化步骤。该步骤的目的除最大量分离出目的核酸外，还应有相应的纯化作用，尽可能去除PCR抑制物。无论检测试剂是否含有核酸分离/纯化的组分，企业都应结合检测试剂的特性，对配合使用的核酸分离/纯化试剂针对声称样本类型的提取效率、提取核酸纯度等做充分的验证，提供详细的验证资料。

2. 准确度

采用多份包含及不包含待测突变位点的HBV核酸阳性临床样本，将试验用体外诊断试剂与Sanger测序或已上市同类产品等进行对比试验，评价检测结果一致性。样本应包括所有阳性突变位点，并包含不同浓度水平。

考虑到同一耐药突变发生在不同基因型毒株时对检测准确度的影响，准确度评价中应适当纳入各种HBV基因型（至少包括B、C、D型）样本，若某些基因型的耐药突变较为罕见，可以采用假病毒样本。

3. 最低检测限

针对所有待测突变位点进行评价，建议采用95%（n≥20）的阳性检出率作为最低检测限确定的标准。对于此类产品，扩增反应终体系中的耐药突变序列所占百分率和总核酸浓度两个因素对最低检测限的影响较大，终体系中耐药突变序列所占百分率越高、所含的总DNA量越多，则越容易检出。因此，试剂盒最低检测限评价主要考虑以下两个方面。

3.1在扩增反应终体系特定核酸浓度下，耐药突变序列所占百分率的最低检测限。

采用野生型临床样本和具有目标基因突变的假病毒样本提取的核酸储备液进行不同比例混合，确定扩增反应终体系中的核酸浓度，并逐渐调整野生型和耐药突变型核酸储备液的比例以得到含不同突变序列百分率的混合液。对各份混合液进行不少于20次的重复检测，确定95%阳性检出率水平下的最低百分率，作为在固定的核酸浓度条件下，可以检测到的最低的突变序列百分率。

3.2在特定突变序列百分率下，反应终体系中核酸浓度的最低检测限。

采用野生型临床样本和具有目标基因突变的假病毒样本提取的核酸储备液进行特定比例混合，再逐级稀释成不同核酸浓度样本，分别对各梯度浓度样本进行不少于20次的重复检测，确定95%阳性检出率的最低核酸浓度。

4.精密度

应对每项精密度评价指标的接受标准做出合理规定，如标准差或变异系数的范围等。针对本类产品的精密度评价主要包括以下要求：

4.1对可能影响检测精密度的主要变量进行验证，除检测试剂（包括核酸分离/纯化组分）本身的影响外，还应对分析仪、操作者、时间、地点、检测轮次等要素进行相关的验证。

4.2应针对所有待测突变位点进行精密度验证。使用临床样本进行评价，样本浓度水平应至少包含弱阳性和中/强阳性，并根据产品特性设定适当的精密度要求，精密度评价中的每一次检测均应从核酸提取开始。

4.3合理的精密度评价周期，例如：为期至少20天的连续检测，每天至少由2人完成不少于2次的完整检测，从而对批内/批间、日内/日间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。如有条件，申请人应选择不同的实验室进行重复实验以对室间精密度进行评价。

5.分析特异性

5.1交叉反应

HBV耐药突变检测试剂交叉反应验证应考虑HBV各种基因突变及其它病原体的交叉反应性，申请人应提供所有用于交叉反应验证的病原体、临床样本的来源、种属、型别、基因突变情况和浓度确认等试验资料。

5.1.1核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状的其它病原体，或待检测样本中可能共存的其它病原体核酸的交叉反应，应采用待测核酸序列阴性、其它核酸高浓度样本进行交叉反应的验证，如：人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人巨细胞病毒、E-B病毒、梅毒螺旋体、人类疱疹病毒6型、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、甲型流感病毒、痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等。

5.1.2申报产品包含的不同耐药突变位点之间的交叉反应，以及申报产品不包含的其它HBV基因突变对被检测位点的影响等。如：rtL180M、rtA181V/T、rtT184、rtS202、rtM204I/V、rtN236T、rtM250等突变位点之间的交叉反应。

5.2干扰物质

潜在的干扰物质主要包括：内源性干扰物质和外源性干扰物质。

5.2.1内源性干扰物质：样本中常见干扰物质对检测结果的影响，如血红蛋白、甘油三酯、胆红素等。

5.2.2外源性干扰物质：常用抗凝剂，临床常用抗病毒药物如：干扰素、拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦酯和富马酸丙酚替诺福韦等对检测结果的影响。

5.2.3建议在待测核酸的临界值水平对每种干扰物质的干扰影响进行检测，并针对各种耐药突变序列分别进行评价。干扰物浓度的分布应覆盖人体生理及病理状态下可能出现的物质浓度。应注明不同干扰物质对被检测物质无干扰的最高限值。

（五）阳性判断值确定资料

对于此类试剂，阳性判断值即为针对每个突变基因能够获得理想的临床灵敏度和临床特异性的临界值（Cutoff），对于荧光探针PCR方法即为Ct值的确定资料。建议采用受试者工作特征曲线（ROC）的方式进行相关研究。申请人应选取适当的足够数量的临床样本进行试验以确定阳性判断值。

（六）稳定性研究资料

稳定性研究资料主要涉及两部分内容，申报试剂的稳定性和适用样本的稳定性研究。前者主要包括实时稳定性（有效期）、开瓶稳定性、冻融次数限制等研究，申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据以及结论。对于实时稳定性研究，应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。

样本稳定性研究，可以在合理的温度范围内，每间隔一定的时间段即对储存样本进行分析验证，从而确认不同类型样本的稳定性。冷冻保存的样本还应对冻融次数进行评价。

对于样本进行核酸提取后不能立即进行检测的，应明确提取核酸的储存条件、储存时间等内容，同时应提供相应的核酸稳定性研究资料。

试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果均应在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中进行详细说明。

（七）产品风险分析资料

申请人应参考YY/T 0316《医疗器械 风险管理对医疗器械的应用》规定的过程和方法，在产品生命周期内可能造成的危害进行识别，对每一危害处境的风险进行判定和评价，形成风险管理报告，控制这些风险并监视控制的有效性，充分保证产品的安全性和有效性。

（八）临床试验

临床试验的开展、方案的制定以及报告的撰写等均应符合相关法规及《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第16号）的要求，如相关法规、文件有更新，临床试验应符合更新后的要求。

1.临床试验方法

1.1已有同类产品上市的情形

选择已上市同类产品作为对比试剂，进行比较研究，评价耐药突变位点的检测性能。

对比试剂的选择应从预期用途、样本要求、检测性能等方面，确认其与试验用体外诊断试剂具有较好的可比性，并提交相应的比对资料。

1.2无同类产品上市的情形

1.2.1如新的乙肝病毒耐药突变位点用于乙肝用药指导已获行业认可（包括：国内相关指南或专家共识、相关药物说明书、临床应用等的认可），在无同类产品上市的情况下，临床试验中可选择Sanger测序法或其他适当的方法作为对比方法进行比较研究，评价耐药突变位点的检测性能。

1.2.2如新的乙肝病毒耐药突变位点用于乙肝用药指导尚未获行业认可，临床试验应包括两个试验目的，耐药突变位点检测性能评价及耐药突变与抗病毒药物敏感性的相关性评价。耐药突变位点检测性能评价可参考1.2.1的试验方法，耐药突变与抗病毒药物敏感性的相关性评价，应以体外表型分析作为参考标准，评价突变位点与体外表型分析的一致性。

针对Sanger测序和体外表型分析方法的建立、验证和质量控制，应提交详细的研究论述，相关内容纳入临床试验报告中。

2.受试者选择和样本例数

2.1受试者选择：临床试验受试者应根据产品声称的适用人群进行选择，应包含各种突变型样本，以及各种可能的干扰样本、交叉反应样本（其它病原体阳性）等。

2.2样本例数

临床试验样本量应满足统计学要求，可采用适当的统计学方法进行估算。根据相应临床试验设计，本临床试验可依据试验用体外诊断试剂相对于对比试剂的阴、阳性符合率或相对于临床参考标准的灵敏度和特异度分别估算最低阴、阳性样本例数。

2.2.1耐药突变位点检测性能评价的样本量估算

对于耐药突变位点检测性能的评价，临床样本量的估算建议采用如下样本量公式计算，

公式中，n为样本量；Z1-α、Z1-β为显著性水平和把握度的标准正态分布的分数位，P0为评价指标的临床可接受标准，PT为试验用体外诊断试剂评价指标预期值。

以已上市同类产品作为对比试剂的比较研究中，阴阳性符合率的临床可接受标准（P0）建议不低于95%，若以Sanger测序法作为对比方法，临床可接受标准（P0）可适当降低。应证明产品与对比试剂/方法的阴阳性符合率（可信区间下限）不低于预设的临床可接受标准（P0）。当评价指标P接近100%时，上述样本量估算方法可能不适用，应考虑选择更加适宜的方法进行样本量估算和统计学分析，如精确概率法等。

如申报产品为多突变位点检测试剂，则其中常见的突变位点阳性样本例数应分别具有统计学意义，罕见的突变位点应有一定的阳性样本例数，保证临床性能得到充分的确认。

2.2.2新基因突变位点与抗病毒药物敏感性的相关性评价的样本量估算

样本量的估算可采用如下抽样调查的公式计算：

公式中n为样本量，Z1-α/2为置信度标准正态分布的分位数，P为评价指标预期值，Δ为P的允许误差大小。应注意，P和Δ的取值应有充分依据，其中Δ的常用取值为0.05，但当预期值更高时应考虑更优的精度。

2.2.3临床试验总体样本量确定时应在上述阴、阳性样本最低样本量估算的基础上，同时考虑其他可能造成受试者脱落的情况以及可能需要纳入的干扰样本、交叉反应样本等情况适当增加入组样本量。

此类产品的检测样本类型一般为血清或血浆，如果样本类型同时包括血清和血浆，且临床前研究证明两种样本类型检测一致性较好，则临床试验可以其中一种样本类型为主完成如上临床试验，同时另一种样本类型采用一定数量样本进行对比试验（同源样本对比或同类产品对比）验证即可，其中应包括一定数量的阳性和阴性样本，阳性样本中尽量包含预期适用的所有突变位点。

3.临床研究单位的选择

应选择不少于3家（含3家）临床试验机构，按照相关法规、指导原则的要求开展临床试验。临床试验机构的选择应充分考虑拟申报产品的特点和预期用途，综合流行病学背景，使临床试验机构和受试者的选择具有一定的地域代表性。实验操作人员应有足够的时间熟悉检测系统的各环节，熟悉临床试验方案。

4. 统计学分析

应选择合适的统计方法对临床试验结果进行统计分析，对于试验用体外诊断试剂与对比试剂（方法）/参考标准的一致性评价，常选择交叉四格表形式总结两种试剂/方法的检测/诊断结果，评价指标一般包括临床灵敏度、临床特异度、阳性符合率和阴性符合率等。

对于此类产品，每种突变类型均应分别进行统计学分析，对于不一致样本，应进行可能的原因分析，如临床试验方案规定采用其他方法进行确认，则确认结果不应纳入统计分析。

5.伦理学要求

临床试验必须符合赫尔辛基宣言的伦理学准则。研究者应考虑临床试验用样本的获得和试验结果对受试者的风险，提请伦理委员会审查，并获得伦理委员会的同意。注册申报时应提交伦理委员会的审查意见。

6.临床试验方案

临床试验实施前，研究人员应从流行病学、统计学、临床医学、检验医学等多方面考虑，设计科学合理的临床试验方案。各临床试验机构应执行统一的临床试验方案，且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案实施，不可随意改动。整个试验过程应在临床试验机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成，申报单位的技术人员除进行必要的技术指导外，不得随意干涉实验进程，尤其是数据收集过程。

试验方案中应确定严格的病例纳入/排除标准，任何已经入选的病例再被排除出临床试验都应记录在案并明确说明原因。在试验操作过程中和判定试验结果时应采用盲法以保证试验结果的客观性。

7.质量控制

临床试验开始前，建议进行临床试验的预试验，以熟悉并掌握相关试验方法的操作、仪器、技术性能等，最大限度控制试验误差。整个试验过程都应处于有效的质量控制下，最大限度保证试验数据的准确性及精密度。

8.临床试验报告撰写

临床试验报告应该对试验的整体设计及各个关键点给予清晰、完整的阐述，应该对整个临床试验实施过程、结果分析、结论等进行条理分明的描述，并应包括必要的基础数据和统计分析方法，最后得出临床试验结论。临床试验报告的撰写参考《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》的相关要求。

（九）产品技术要求

申请人应当在原材料质量和生产工艺稳定的前提下，根据申请人产品研制、前期性能评估等结果，依据国家标准、行业标准及有关文献，按照《医疗器械产品技术要求编写指导原则》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第9号）的有关要求，编写产品技术要求。

该试剂的产品性能指标应主要包括：物理性状、阴/阳性参考品符合率、精密度、最低检测限等。性能指标应依据分析性能评估试验结果确定，检验方法应明确具体操作方法和使用的样本及参考品情况。

该产品为第三类体外诊断试剂，申请人应按照《医疗器械产品技术要求编写指导原则》的要求，以附录形式明确主要原材料、生产工艺及半成品要求，附录的编制应符合相关编写规范的要求。

（十）产品检验报告

应依据产品技术要求，在符合《办法》要求的医疗器械检验机构进行连续3个生产批次样品的检验，提供检验合格报告。

（十一）产品说明书

说明书承载了产品预期用途、标本采集及处理、检验方法、检验结果解释以及注意事项等重要信息，是指导实验室工作人员正确操作、临床医生针对检验结果给出合理医学解释的重要依据，因此产品说明书是体外诊断试剂注册申报最重要的文件之一。产品说明书的格式应符合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第17号）的要求，进口体外诊断试剂的中文说明书除格式要求外，其内容应尽量保持与原文说明书的一致性，翻译力求准确且符合中文表达习惯。产品说明书中相关技术内容均应与申请人提交的注册申报资料中的相关研究结果保持一致，如某些内容引用自参考文献，则应以规范格式对此内容进行标注，并单独列明文献的相关信息。

结合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的要求，下面对乙型肝炎病毒耐药相关的基因突变检测试剂说明书的重点内容进行详细说明，以指导注册申报人员更合理地完成说明书编制。

1.【预期用途】

1.1本产品用于体外定性检测来自乙型肝炎病毒核酸阳性患者的血清/血浆样本中的×××（具体的突变型）耐药突变。本产品用于对×××药物耐药的辅助诊断。

1.2适用人群：应为核苷（酸）类似物治疗过程中出现病毒学突破的乙型肝炎患者，除非有明确证据表明初治患者感染乙肝病毒来自于接受核苷（酸）类似物抗病毒治疗患者。一般不主张对初治患者进行基因型耐药检测。

1.3简要介绍乙型肝炎病毒耐药突变位点的特征，包括突变位点的描述，所检测的耐药突变位点与相应药物的相关性。

1.4强调该试剂盒检测结果仅供临床参考，不应作为治疗药物调整的唯一依据，临床医生应结合患者病情及其他实验室检测指标等因素对患者治疗进行综合判断。

2.【检验原理】

详细说明试剂盒检测技术原理，包括核酸分离/纯化方法、原理。说明检测的耐药突变位点信息；介绍引物及探针设计、不同样品反应体系（管）组合、质控品设置及荧光信号标记等。如添加了相关的防污染组分（如尿嘧啶DNA糖基化酶，即UDG/UNG等），也应对其作用机理作适当介绍。

3.【主要组成成分】

详细说明试剂盒内各组分的名称、数量、成分、浓度等信息，如含有生物源性物质，应说明其生物学来源、活性及其他特性；说明不同批号试剂盒中各组分是否可以互换。

试剂盒中不包含但对该项检测必须的组分，应列出相关试剂的生产企业、产品名称、货号以及医疗器械注册证号/备案号（如有）等详细信息。当试剂盒中不包含用于核酸分离/纯化的试剂组分时，应在此注明经验证后可以配合使用的商品化核酸分离/纯化试剂盒的如上信息。

4.【储存条件及有效期】

试剂盒的效期稳定性、开瓶稳定性、复溶稳定性、冻融次数要求等，应与相应的稳定性研究结论一致。注明“生产日期及有效期至（或失效日期）见标签。”

5.【适用仪器】

明确所有适用的仪器型号，提供与仪器有关的重要信息以指导用户操作。

6.【样本要求】

明确适用的样本类型，并详细描述样本采集及预处理要求、运输要求、保存条件及期限等。

7.【检验方法】

详细说明实验操作的各个步骤，包括：

7.1试剂配制方法、注意事项。

7.2核酸分离/纯化的条件、步骤及注意事项。质控品参与样本核酸的平行提取的要求等。

7.3扩增反应前准备：各组分加样体积、顺序、相关注意事项等。

7.4 PCR各阶段的温度、时间设置、循环数设置及相关注意事项。

7.5仪器设置：特殊参数，待测基因、内标的荧光通道选择等。

7.6质量控制：说明质控品的检测要求。

8.【阳性判断值】

简要总结阳性判断值研究方法及结论。明确说明样本的阳性判断值。

9.【检验结果的解释】

说明质控品、内标的正确结果要求，结合质控品以及样本管中靶基因和内标的检测结果，对所有可能出现的结果组合及相应的解释进行详述。检验结果的解释应以阳性判断值的研究结论为依据。

10.【检验方法的局限性】

应至少包括如下描述：

10.1本试剂检测结果应结合患者临床症状及其他相关医学检查结果进行综合分析，不得单独作为患者管理的依据。

10.2本产品仅检测靶标区域内突变引起的耐药。由其他基因或基因区域的突变、以及其他耐药机制引起的耐药本产品不能检出。

10.3不合理的样本采集、转运及处理以及不当的实验操作和实验环境均有可能导致假阴性或假阳性结果。

10.4未经验证的其他干扰或PCR抑制因子等可能会导致假阴性结果。

11.【产品性能指标】

详述分析性能评估的试验结果并简要描述临床试验的基本信息、试验方法和结论。

12.【注意事项】

应至少包括以下内容：

12.1如该产品含有人源或动物源性物质，应给出生物安全性的警告。

12.2临床实验室应严格按照《医疗机构临床基因扩增实验室管理办法》（卫办医政发〔2010〕194号或现行有效版本）等有关分子生物学实验室、临床基因扩增实验室的管理规范执行。

12.3强调产品性能仅针对声称的适用样本类型及【样本要求】项下说明的样本采集和处理方法进行了验证，其他样本类型或样本采集、处理方法不能保证产品性能。

12.4强调：实验操作人员应接受过基因扩增或分子生物学方法检测的专业培训，具备相关的实验操作资格，实验室应具备合理的生物安全防备设施及防护程序。

三、参考文献：

1. 乙型肝炎病毒耐药专家委员会，乙型肝炎病毒耐药专家共识：2009年更新，中华实验和临床感染病杂志，2009年2月第3卷第l期。

2. 颜学兵，周培培，王磊，对乙型肝炎病毒耐药专家共识的几点看法，中华实验和临床感染病杂志，2008，2：205-209。

3. 中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会，慢性乙型肝炎防治指南，中华肝脏病杂志，2005，13：881-891。

4. 张树永，陈琛，马庆伟，曲芬，乙型肝炎抗病毒治疗中的耐药基因突变检测技术，传染病信息，2016年10月30日第29卷第5期。

5. 王贵强，王福生，成军等 慢性乙型肝炎防治指南（2015

年版），中华实验和临床感染病杂志，2015，9（5）：1-18。

6. 丁善龙，王杰，鲁凤民，乙型肝炎研究及我国防治现状，传染病信息，2013，26（6）：368-372。

7. 姚伟明，徐东平，抗HBV药物靶位的研究进展，传染病信息，2013，26（6）：323-326。

8. Tim Shaw，Angeline Bartholomeusz，Stephen Locarnini. HBV drug resistance：Mechanisms，detection and interpretation. Journal of Hepatology，44，（2006）：593-606.

9. Fabien Zoulim，Stephen Locarnini. Hepatitis B Virus Resistance to Nucleos（t）ide. Analogues Gastroenterology，2009，137：1593-1608.

10. Paul Martin，Daryl T.-Y. Lau. A Treatment Algorithm for the Management of Chronic Hepatitis B Virus Infection in the United States：2015 Update. Clinical Gastroenterology and Hepatology，2015，13：2071-2087.

四、起草单位

国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心。